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呼吸道感染检测病毒性技术原理国内版 [复制链接]

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呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一,发病率在各国居民发病率总体结构中占主要地位,每年流行高峰期约有10%的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染会导致鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、轻度咽炎、全身发热等症状,严重的会导致呼吸困难甚至死亡。急性呼吸道感染己经成为国内外儿童重要感染性疾病之一,其发病率已居儿童各类疾病的首位。引起儿童呼吸道感染的病原体主要有病毒、细菌、支原体和衣原体等,快速和准确的诊断以及适当的治疗,是减少儿童住院和不必要的抗菌药物使用的重要前提。因此,呼吸道病原体的快速检测,对临床早期诊断有着非常重要的意义。本推送主要介绍目前国内企业检测病毒引起的呼吸道感染所使用的方法和注册试剂盒。

呼吸道感染的病原体非常复杂,难以统计到每一项试剂盒。由于至今尚未有防止病毒的特效方法(仅HPV病毒有疫苗,其它病毒均没疫苗销售),病毒引起的呼吸道感染仍然十分严峻。近年来多次爆发的流感病毒(甲型、乙型流感病毒等),更是造成了巨大的社会经济负担。呼吸道合胞病毒是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原,可引起间质性肺炎及毛细管支气管炎。冠状病毒能够引起严重急性呼吸综合征(SARS),年爆发的SARS就是由冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎。本推送主要以“流感病毒”、“合胞病毒”和“冠状病毒”为关键词,介绍目前国内企业病毒引起的呼吸道感染检测方法和试剂盒。

试剂盒统计

目前流感病毒的试剂盒和企业较多,且荧光PCR是最主流的方法,年后有32个试剂盒在NMPA注册。其次是胶体金法,共有20个试剂盒。其它方法还包括酶联免疫、化学发光及恒温扩增等方法。由于联合检测多种病原体对呼吸道感染非常重要,这些试剂盒中共有17项流感病毒联合检测试剂盒。具体如下所示:

合胞病毒的注册试剂盒相对流感病毒较少,其中采用胶体金和酶免的较多。包括硕世、之江、达安、普瑞康、华瑞安等企业有荧光PCR试剂盒注册。海尔施采用PCR毛细电泳片段分析法进行13种呼吸道病原体检测。博奥生物采用恒温扩增芯片法进行呼吸道病原菌核酸检测。具体如下所示:

冠状病毒的注册试剂盒相对最少,且基本上都是通过PCR的方法进行病毒核酸检测。主要企业有华瑞安、达安等。

检测方法概述

目前市场上针对呼吸道感染病原体的检测方法主要有荧光PCR法、免疫法和细菌培养法。荧光PCR法是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时监测,定性或定量检测目的基因;免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白;细菌培养法是把病原体细菌在特定培养基上进行培养,再对产生的细菌菌落进行观察检测。

普通荧光PCR检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性,但是多是针对单项或几项病原体,想要检测多种病原体就要采用多套不同的检测试剂盒搭配,操作不便且成本较高;而免疫法检测试剂虽然可以同时检测多项病原体,但是由于免疫法检测的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体,因此存在一个较长的空窗期,并且灵敏度相对较低;而对于细菌类病原体的检测,采用细菌培养法虽然准确率高,但是耗时较长,培养效果差,很多细菌无法培养,延误了最佳治疗时机。

由于之前的推送已经介绍了常见方法的技术原理,这里讲讲一些新出现的检测方法。

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双扩增法

双扩增法由武汉中帜生物采用,具体原理如图所示。其具有下列三个特点:1、无需PCR扩增靶分子,通过多生物素分子聚合体对待检测靶分子进行信号放大,提高检测灵敏度至几个靶分子。2、无需对核酸分子进行模板指数性扩增,降低假阳性率。3、无需核酸提取,细胞裂解后直接进行检测分析,方法简便。

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RNA恒温扩增-金探针层析法

传统的层析试纸条使用方便,但检测灵敏度却不行。为了增加检测的灵敏度,可利用分子扩增技术进行信号放大,最后使用金标探针进行层析捕获。尽管这种方法增加了扩增这一步而延长了检测时间,但却大大增加了检测的灵敏度。使用恒温扩增的原因在于时间相对短,不需要温度循环,对仪器要求也更低。

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质谱和NGS

细菌的质谱分析和病原微生物的二代测序技术(NGS)是新兴的技术。细菌的质谱分析对常见细菌和酵母菌的属的鉴定率能到95%以上。另外,该技术大大缩短了细菌鉴定的时间,而且其成本也较常规鉴定方法低。NGS技术具有病原菌阳性检出率高、快速、能检出未知病原体等特点,被用于探究疑难感染病的病因。随着二代测序成本的降低,未来会有较大的发展。

从检测样本来看,目前大多数试剂盒都是通过检测人口咽拭子样本中的病毒,通常采集喉部、鼻腔和鼻咽分泌物或气管吸出物或洗液作为实验标本,利用直接抗原检测、病毒分离或逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,检测流感特异性RNA,通过实验室方法确认流感病毒。另一部分检测人血清中流感病毒IgM、lgG抗体。其中POCT式的试剂盒主要通过检测病毒抗原为主。

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